Анаэробы - это бактерии. Особенности анаэробов, классификация и методы культивирования

Самой богатой по количеству и разнообразию путей метаболизма группой организмов являются прокариоты. Часть из них, чтобы синтезировать АТФ (основную энергетическую "валюту" клетки), используют схему аэробного дыхания, типичную для большинства эукариотов. Микроорганизмы, не обладающие данным механизмом, называются анаэробами. Эти бактерии способны получать энергию из химических соединений без участия кислорода.

Классификация анаэробов

По отношению к кислороду выделяют две группы анаэробных бактерий:

• факультативные - могут получать энергию как с участием кислорода, так и без него, переход с одного типа метаболизма на другой зависит от условий среды;
• облигатные - никогда не используют O₂.

Для факультативных анаэробов бескислородный тип метаболизма имеет приспособительное значение, и бактерии прибегают к нему только в крайнем случае, при попадании в анаэробную среду. Это объясняется тем, что кислородное дыхание энергетически гораздо выгодней.

У другой группы анаэробов отсутствует биохимический механизм использования O₂ для окисления соединений, и присутствие этого элемента в окружающей среде не только не полезно, но и токсично.

Выделяют несколько типов облигатных анаэробов, различающихся по устойчивости к присутствию молекулярного кислорода:

• строгие погибают даже при незначительной концентрации O₂;
• умеренно строгие характеризуются средней или высокой устойчивостью к присутствию кислорода;
• аэротолерантные – особая группа прокариот, способная не только выживать, но и расти в воздушной среде.

Отношение конкретной бактерии к кислороду можно определить по характеру ее роста в толще питательной среды.

К аэротолерантным микроорганизмам относят молочнокислые бактерии. Некоторые виды (например, Clostridium) могут быть устойчивы к высокой концентрации кислорода за счет образования эндоспор.

Анаэробный энергетический метаболизм

Все анаэробы – это типичные хемотрофы, поскольку в качестве источника энергии используют энергию химических связей. При этом энергетическими донорами могут быть как органические вещества (хемоорганотрофия), так и неорганические (хемолитотрофия).

У бактерий-анаэробов существуют две разновидности бескислородного метаболизма: дыхание и брожение. Принципиальное различие между ними заключается в механизме ассимиляции энергии.

Так, при брожении энергия сначала запасается в фосфагенной форме (например, в виде фосфоенолпирувата), а затем при участии цитозольных дегидрогеназ происходит субстратное фосфолирирование АДФ. Электроны при этом передаются эндогенному или экзогенному акцептору, который становится побочным продуктом процесса.

При дыхательном типе метаболизма энергия запасается в специфическом соединении – Pmf, который либо сразу используется для клеточных процессов, либо поступает в сосредоточенную на мембране электротранспортную цепь, где синтезируется АТФ. Только, в отличие от аэробного дыхания, конечным акцептором электронов служит не кислород, а другое соединение, которое может иметь как органическую, так и неорганическую природу.

Разновидности анаэробного дыхания

Основная задача, которую решает анаэробная бактерия с дыхательным типом метаболизма, – найти альтернативу молекулярному кислороду. Именно от этого зависит энергитический выход реакции. В зависимости от вещества, выполняющего роль терминального акцептора, различают следующие виды анаэробного дыхания:

• нитратное;
• железное;
• фумаратное;
• сульфатное;
• серное;
• карбонатное.

Анаэробное дыхание менее эффективно, чем аэробное, но по сравнению с брожением дает гораздо больший энергетический выхлоп.

Анаэробное деструктивное сообщество бактерий

Данный тип микробиоты образуется в богатых органикой экологических нишах, в которых кислород практически полностью израсходован (затапливаемые почвы, подземные гидросистемы, илистые отложения и т.д.). Здесь происходит ступенчатая деградация органических соединений, осуществляемая двумя группами бактерий:

• первичные анаэробы отвечают за первый этап дессимиляции органики;
• вторичные анаэробы – это микроорганизмы с метаболизмом дыхательного типа.

Среди первичных анаэробов различают гидролитиков и диссипотрофов, которые связаны друг с другом трофическими взаимодействиями. Гидролитики образуют биопленки на поверхности твердых субстратов и продуцируют гидролитические экзоферменты, которые расщепляют сложные органические соединения на олигомеры и мономеры.

Образовавшиеся питательный субстрат в первую очередь используются самими гидролитиками, но также и диссипотрофами. Последние обычно менее кооперированы и не выделяют значительных количеств экзоферментов, поглощая готовые продукты гидролиза биополимеров. Характерным представителем диссипотрофов являются бактерии рода Syntrophomonas.

Культивирование

Особые требования по выращиванию предъявляются только к облигатно-анаэробным бактериям. Факультативные прекрасно размножаются в кислородной среде.

Методы культивирования анаэробных микроорганизмов подразделяются на три категории: химические, физические и биологические. Их основная задача заключается в том, чтобы понизить либо полностью исключить присутствие кислорода в питательной среде. Степень допустимой концентрации O₂ определяется уровнем толерантности конкретного анаэроба.

Физические методы

Суть физических методов состоит в том, чтобы убрать кислород из воздушной среды, с которой контактирует культура, либо полностью исключить контакт бактерий с воздухом. К данной группе относят следующие технологии культивирования:

• выращивание в микроаэростате – специальном приборе, в котором вместо атмосферного воздуха создается искусственная газовая смесь;
• глубинное культивирование – посев бактерий не на поверхность, а высоким слоем или в толщу среды таким образом, чтобы туда не проникал воздух;
• использование вязких сред, в которых диффузия O₂ снижается с увеличением плотности;
• выращивание в анаэробной банке;
• заливка поверхности среды вазелиновым маслом или парафином;
• использование CO₂-инкубатора;
• применение анаэробной станции SIMPLICITY 888 (самый современный метод).

Обязательной частью физических методов является предварительное кипячение питательной среды, чтобы удалить из нее молекулярный кислород.

Использование химических веществ

Химические соединения, используемые для выращивания анаэробов, разделяют на 2 группы:

• Поглотители кислорода сорбируют молекулы O_2. Поглощающая способность зависит от вида вещества и объема воздушного пространства в среде. Наиболее часто применяют пирогаллол (щелочной раствор), металлическое железо, хлорид одновалентной меди, дитионит натрия.
• Восстанавливающие агенты (цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота и др.) снижают окислительно-восстановительный потенциал среды.

Особой разновидностью химических методов является использование газогенерирующих систем, в состав которых входят агенты, генерирующие водород и углекислый газ, а O₂ поглощает палладиевый катализатор. Такие системы применяют в замкнутых емкостях для выращивания (анаэростаты, пластиковые пакеты и т.д.).

Биологические методы

К биологическим методам относят совместное выращивание анаэробов и аэробов. Последние удаляют из среды кислород, создавая условия для роста своих "сожителей". В качестве сорбирующих агентов могут использовать и факультативно-анаэробные бактерии.

Существует две модификации данного метода:

• Посев двух культур на разные половины чашки Петри, которую затем закрывают крышкой.
• Посев с использованием "часового стекла", содержащего среду с аэробной бактерией. Таким стеклом накрывают чашку Петри, сплошным слоем засеянную анаэробной культурой.

Иногда аэробные микроорганизмы используют на этапе подготовки жидкой питательной среды для инокуляции анаэробов. После удаления остаточного кислорода аэроба (например, E. colli) убивают нагреванием, а затем засевают нужную культуру.

Выделение чистой культуры

Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, принадлежащую к одному виду, обладающую одними свойствами и полученную из одной клетки. Для получения группы бактерий с такими характеристиками обычно используют методы истончающего штриха и предельных разведений, но работа с анаэробами - это особый процесс, требующий исключения контакта с кислородом при получении изолированных колоний.

Существует несколько способов выделения чистой культуры анаэробов. К ним относятся:

• Метод Цейсслера – посев истончающим штрихом на чашки Петри с созданием анаэробных условий и последующей инкубацией в термостате (от 24 до 72 часов).
• Метод Вейнберга – выделение анаэробов в культуру с использованием сахарного агара (посев высоким столбиком), бактерии переносятся запаянным капилляром. Вначале материал помещается в пробирку с изотоническим раствором (этап разведения), затем в пробирку с агаром, имеющим температуру 40-45 градусов, в которой тщательно перемешивается со средой. После этого происходит последовательный пересев в еще 2 пробирки, последняя из которых охлаждается под струей воды.
• Метод Перетца – разведенный в изотоническом растворе материал заливают в чашку Петри таким образом, чтобы она заполнила пространство под лежащей на ее дне стеклянной пластинкой, на которой и должен начаться рост.

Во всех трех методах материал из полученных изолированных колоний пересевается на среду контроля стерильности (СКС) либо среду Китта-Тароцци.